Основной метод используемый при клональном размножении растений это

Клональное микроразмножение и преимущества этого метода

Клональное микроразмножение – принципиально новый метод вегетативного размножения.

Клональное микроразмножение – это принципиально новый метод вегетативного размножения – получение в условиях in vitro (в пробирке) неполовым путем растений, генетически идентичных исходному экземпляру.

Описание:

Для семенных растений характерно два способа размножения: семенной и вегетативный. Оба эти способа имеют как преимущества, так и недостатки. К недостаткам семенного размножения следует отнести, в первую очередь, генетическую пестроту получаемого посадочного материалa и длительность ювенильного периода. При вегетативном размножении сохраняется генотип материнского растения и сокращается продолжительность ювенильного периода. Однако для большинства видов (в первую очередь для древесных пород) проблема вегетативного размножения остается до конца не решенной.

Это обусловлено следующими причинами:

не все породы, даже на ювенильной стадии, могут размножаться вегетативным способом с требуемой эффективностью (дуб, сосна, ель, орехоплодные и др.);

практически невозможно с помощью черенкования размножать многие виды древесных пород в возрасте старше 10—15 лет;

не всегда удается получать стандартный посадочный материал (возможность накопления и передачи инфекции);

трудоемкостью и сложностью операций при размножении взрослых (древесных) растений с помощью прививок;

неэффективностью разработанных технологий для получения достаточного количества генетически однородного материала в течение года.

Достижения в области культуры клеток и тканей привели к созданию принципиально нового метода вегетативного размножения — клонального микроразмножения (получение в условиях in vitro (в пробирке), неполовым путем растений, генетически идентичных исходному экземпляру). В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки реализовывать присущую ей тотипотентность, то есть под влиянием экзогенных воздействий давать начало целому растительному организму.

В соответствии с научной терминологией клонирование подразумевает получение идентичных организмов из единичных клеток.

Клональное микроразмножение включает следующие методы:

– культивирование меристематической ткани, выделенной из апикальных и латеральных вегетативных почек растения;

– активизация уже имеющихся у микрорастений меристематических тканей путем микрочеренкования;

– индукция возникновения адвентивных почек тканями микрорастения.

Этапы клонального микроразмножения:

Процесс клонального микроразмножения можно разделить на 4 этапа:

1. Выбор растения-донора, изолирование эксплантов и получение хорошо растущей стерильной культуры.

2. Собственно микроразмножение, когда достигается получение максимального количества меристематических клонов.

3. Укоренение размноженных побегов с последующей адаптацией их к почвенным условиям, а при необходимости депонирование растений-регенерантов при пониженной температуре (+2оС, +10оС).

4. Выращивание растений в условиях теплицы и подготовка их к реализации или посадке в поле.

На каждом этапе культивирования микрорастений подбирается определенный состав питательных сред. Перед тем как вводить в культуру тот или иной вид растений, проводится его тестирование на вирусы, учитывая тот факт, что для каждого семейства и вида растений характерен свой «набор» вирусов, который влияет как на внешний вид растения, так и на его обменные процессы, фотосинтез, репродуктивность и качество урожая. На каждом этапе культивирования растений осуществляется жесткий контроль качества.

Адаптация микрорастений к нестерильным условиям, а затем их доращивание в контролируемых условиях проводится в теплицах.

Благодаря применению технологии микропрививки по авторской разработке Высоцкого В.А. выпускаются из теплицы полукарликовые сортовые саженцы, которые доращиваются в открытом грунте до пригодности к высадке в сад.

Преимущества:

– клональное микроразмножение способствует получению генетически однородного посадочного материала;

– освобождение растений от вирусов за счет использования меристемной культуры;

– высокий коэффициент размножения (10 5 – 10 6 – для травянистых, цветочных растений, 10 4 – 10 5 – для кустарниковых древесных растений и 10 4 – для хвойных);

– сокращение продолжительности селекционного процесса;

– ускорение перехода растений от ювенильной к репродуктивной фазе развития;

– размножение растений, трудно размножаемых традиционными способами;

– возможность проведения работ в течение всего года;

– возможность автоматизации процесса выращивания.

Применение:

– оздоровление посадочного материала,

– быстрое размножение ценных хозяйственных сортов,

– размножение исчезающих видов растений.

клональное микроразмножение оздоровление растений
клональное микроразмножение растений
метод клонального микроразмножения
методы клонального микроразмножения растений
преимущество клонального микроразмножения
роль гормонов в клональном микроразмножении растений
факторы влияющие на процесс клонального микроразмножения
этапы клонального микроразмножения

Источник



Раздел «Культуры растительных клеток»

Микроклональное размножение и оздоровление растений

Методы микроклонального размножения

Методы клонального микроразмножения

Существует много методов клонального микроразмножения, а также различных их классификаций. Согласно одной из них, предложенной Мурасиге в 1977 году, процесс можно осуществлять следующими путями:

1. Активация пазушных меристем.

2. Образование адвентивных побегов тканями экспланта.

3. Возникновение адвентивных побегов в каллусе.

4. Индукция соматического эмбриогенеза в клетках экспланта.

5. Соматический эмбриогенез в каллусной ткани.

6. Формирование придаточных эмбриоидов в ткани первичных соматических зародышей (деление первичных эмбриоидов).

Н. В. Катаева и Р. Г. Бутенко (1983) выделяют два принципиально различных типа клонального микроразмножения:

1. Активация уже существующих в растении меристем (апекс стебля, пазушные и спящие почки стебля).

2. Индукция возникновения почек или эмбриоидов de novo :

а) образование адвентивных побегов непосредственно тканями экспланта;

б) индукция соматического эмбриогенеза;

в) дифференциация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани.

Основной метод, использующийся при клональном микроразмножении растений — активация развития уже существующих в растении меристем. Он основан на снятии апикального доминирования (рис. 18).

Этого можно достичь двумя путями: а) удалением верхушечной меристемы стебля и последующим микрочеренкованием побега in vitro на безгормональной среде; б) добавлением в питательную среду веществ цитокининового типа действия, индуцирующих развитие многочисленных пазушных побегов. Как правило, в качестве цитокининов используют 6-бензиламинопурин (БАП) или 6-фурфуриламинопурин (кинетин) и зеатин.

Рис. 18. Схема размножения растений методом активации уже существующих меристем (по А. Р. Родину, Е. А. Калашниковой, 1993): 1 – путем удаления верхушечной меристемы: 2 – добавлением цитокининов в среду (б/г – среда без гормонов, Ц – цитокинин, А – ауксин)

Полученные таким образом побеги отделяют от первичного экспланта и вновь самостоятельно культивируют на свежеприготовленной питательной среде, стимулирующей пролиферацию пазушных меристем и возникновение побегов более высоких порядков.

Часто в качестве экспланта используют верхушечные или пазушные почки, которые изолируют из побега и помещают на питательную среду с цитокининами. Образующиеся пучки побегов делят, при необходимости черенкуют и переносят на свежую питательную среду. После нескольких пассажей, добавляя в питательную среду ауксины, побеги укореняют in vitro (рис. 19), а затем переносят в почву, где создают условия, способствующие адаптации растений (рис. 20).

микроклональное размножение - укоренение в пробирке

Рис. 19. Образование корней побегами розы при добавлении в питательную среду 2 мг/л 2,4-Д

4-й этап микроклонального размножения - адаптация пробирочных растений к почвенным условиям

Рис. 20. Адаптация пробирочных роз к почвенным условиям микроклональное размножение гвоздики

В настоящее время этот метод широко используется в производстве посадочного материала сельскохозяйственных культур, как технических, так и овощных, а также для размножения культур промышленного цветоводства (например, гвоздики, рис. 21), тропических и субтропических растений, плодовых и ягодных культур, древесных растений. Для некоторых культур, таких как картофель, технология клонального размножения поставлена на промышленную основу. Применение метода активации развития существующих меристем позволяет получать из одной меристемы картофеля более 100000 растений в год, причем технология предусматривает получение в пробирках микроклубней — ценного безвирусного семенного материала.

Рис. 21. Пробирочная гвоздика

Второй метод — индукция возникновения адвентивных почек непосредственно тканями экспланта. Он основан на способности изолированных частей растения при благоприятных условиях питательной среды восстанавливать недостающие органы и таким образом регенерировать целые растения. Можно добиться образования адвентивных почек почти из любых органов и тканей растения (изолированного зародыша, листа, стебля, семядолей, чешуек и донца луковиц, сегментов корней и зачатков соцветий). Этот процесс происходит на питательных средах, содержащих цитокинины в соотношении с ауксинами 10:1 или 100:1. В качестве ауксина используют ИУК или НУК. Таким способом были размножены многие представители семейства лилейных, томаты, древесные растения (из зрелых и незрелых зародышей).

Достаточно хорошо разработана технология клонального размножения земляники, основанная на культивировании апикальных меристем. Меристематические верхушки изолируют из молодых, свободных от вирусных болезней растений, и выращивают на питательной среде МС, содержащей БАП в концентрации 0,1 — 0,5 мг/л. Через 3 — 4 недели культивирования меристема развивается в проросток, в основании которого формируются адвентивные почки, быстро растущие и дающие начало новым почкам. В течение 6-8 недель образуется конгломерат почек, связанных между собой соединительной тканью и находящихся на разной стадии развития. Появляются листья на коротких черешках, в нижней части которых формируются новые адвентивные почки. Эти почки разделяют и пересаживают на свежую питательную среду. На среде без регуляторов роста за 4 — 5 недель формируются нормальные растения с корнями и листьями. От одного материнского растения таким образом можно получить несколько миллионов растений-регенерантов в год.

Третий метод, практикуемый при клональном микроразмножении, основывается на дифференциации из соматических клеток зародышеподобных структур, которые по своему виду напоминают зиготические зародыши (рис. 22). Этот метод получил название соматического эмбриогенеза. В отличие от развития in vivo, соматические зародыши развиваются асексуально вне зародышевого мешка и по своему внешнему виду напоминают биполярные структуры, у которых одновременно наблюдается развитие апикальных меристем стебля и корня. Согласно Стеварду, соматические зародыши проходят 3 стадии развития: глобулярную, сердцевидную, торпедовидную и в конечном итоге имеют тенденцию развития в проросток. На рисунке 3 показан конечный результат развития – растение пшеницы.

Читайте также:  Готовая презентация комнатные растения

Рис. 22. Соматический эмбриогенез в каллусной ткани

Наиболее впечатляющим применением метода соматического эмбриогенеза стало размножение гвинейской масличной пальмы (Elaeis guineensis), масло которой широко используется при производстве маргарина и пищевого масла. Масличная пальма в природе не образует побегов и боковых ростков, что затрудняет ее вегетативное размножение. Культивирование черенков in vitro также невозможно. Было решено получить скопления клеток недифференцированной ткани (каллусы) путем дедифференцировки специфических тканей, а затем культивировать их до регенерации целых проростков. В первой культуральной среде каллусы из фрагментов листьев развивались в течение 90 дней, при переносе во вторую и третью культуральные среды превращались в "эмбриоиды". Эмбриоиды размножались самопроизвольно, в течение месяца число эмбриоидов возрастало втрое, а за год из 10 эмбрионов можно было получить потомство численностью 500000 растений.

Формирование эмбриоидов в культуре тканей осуществляется в несколько этапов. Сначала происходит дифференциация клеток под влиянием ауксинов, добавленных в питательную среду (2,4-Д) и превращение их в эмбриональные. Получить эмбриоиды из этих клеток можно уменьшая концентрацию ауксинов или исключая их из питательной среды. Соматические зародыши представляют собой полностью сформированные зародыши, из которых путем соответствующего капсулирования можно получить искусственные семена.

Четвертый метод клонального микроразмножения — дифференциация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани (рис. 23).

Рис. 23. Дифференциация придаточных почек в каллусной ткани

Практически он мало используется с целью получения посадочного материала in vitro. Это связано с тем, что при частом пассировании каллусной ткани может изменяться плоидность регенерируемых растений, наблюдаются структурные перестройки хромосом и накопление генных мутаций. Наряду с генетическими изменениями отмечаются и морфологические: низкорослость, неправильное жилкование листьев, образование укороченных междоузлий, пониженная устойчивость к болезням и вредителям. В то же время, некоторые недостатки этого метода в селекционной работе оборачиваются преимуществами.

микроклональное размножение гвоздики

Рис. 24. Формирование побегов каллусной тканью пшеницы

Кроме того, в некоторых случаях он является единственно возможным способом размножения растений в культуре тканей. Через каллусную культуру успешно размножаются сахарная свекла, злаковые (рис. 24), представители рода Brassica, подсолнечник и другие культуры.

Источник

Клональное микроразмножение растений

В природе существует два способа размножения растений: половой (семенной) и вегетативный. Эти способы имеют свои преимущества и недостатки. К недостаткам семенного размножения следует отнести генетическую пестроту получаемого посадочного материала и длительность ювенильного периода. При вегетативном размножении сохраняется генотип материнского растения и сокращается продолжительность ювенильного периода. Однако для большинства видов (в первую очередь для древесных пород) проблема вегетативного размножения остается до конца не решенной.

Это обусловлено следующими причинами:
1) не все породы, даже на ювенильной стадии, могут размножаться вегетативным способом с требуемой эффективностью (дуб, сосна, ель, орехоплодные и др.);

2) практически невозможно с помощью черенкования размножать многие виды древесных пород в возрасте старше 10-15 лет;

3) не всегда удается получать стандартный посадочный материал (существует возможность накопления и передачи инфекции);

4) операции при размножении взрослых (древесных) растений с помощью прививок отличаются трудоемкостью и сложностью;

5) разработанные технологии не эффективны для получения достаточного количества генетически однородного материала в течение года.

Достижения в области культуры клеток и тканей привели к созданию принципиально нового метода вегетативного размножения — клонального микроразмножения (получение в условиях in vitro (в пробирке) неполовым путем растений, генетически идентичных исходному экземпляру). В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки реализовывать присущую ей тотипотентность, т.е. под влиянием экзогенных воздействий давать начало целому растительному организму.

Для обозначения растений, полученных бесполым размножением, в 1903 г. Уэббер из Министерства сельского хозяйства США ввел термин клон от греч. clon — черенок (побег), пригодный для размножения.

Клон — популяция клеток, возникших из одной клетки посредством митоза, или группа растений, развившихся вегетативным или бесполым путем, все члены которой произошли из одной повторно культивируемой клетки.
Клональное микроразмножение — получение in vitro неполовым путем растений, генетически идентичных исходному.

Этапы и методы клонального микроразмножения растений

Процесс клонального микроразмножения можно разделить на четыре этапа: 1 — выбор растения-донора (донор — растение, часть которого вводится в культуру), изолирование эксплантов (эксплант — ткань, взятая из своего оригинального места и перенесенная в искусственную среду для роста и поддержания жизнедеятельности) и получение хорошо растущей стерильной культуры; 2 — собственно микроразмножение, когда достигается получение максимального количества мериклонов (микропобегов); 3 — укоренение размноженных побегов с последующей адаптацией их к почвенным условиям, а при необходимости депонирование растений-регенерантов при пониженной температуре (2-10 С); 4 — выращивание растений в условиях теплицы и подготовка их к реализации или посадке в поле (рис. 4.1).


Рис. 4.1. Схема клонального микроразмножения растений: I путь -активация развития существующих меристем; II путь — индукция возникновения адвентивных почек; 1 — выбор исходного экспланта; 2 — получение стерильной культуры; 3 — образование адвентивных почек на первичном экспланте; 4 — рост почек и формирование микропобегов; 5 — размножение микропобегов; 6 — укоренение микропобегов; 7 — депонирование растений-регенерантов; 8 — акклиматизация растений к грунту; 9 — высадка регенерантов в поле

Существует много методов клонального микроразмножения. Различные авторы, проводя индивидуальные исследования по влиянию условий культивирования эксплантов на процессы морфогенеза, наблюдали разные ответные морфогенетические реакции на изменение условий выращивания, что, в свою очередь, способствовало созданию новых классификаций методов клонального микроразмножения.

В литературе предложены следующие методы микроразмножения растений: активация развития уже существующих в растении меристем (апекс стебля, пазушные и спящие почки стебля); индукция возникновения адвентивных почек непосредственно тканями экспланта; индукция соматического эмбриогенеза; дифференциация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани.

Первый метод, используемый при клональном микроразмножении растений, — это активация развития уже существующих в растении меристем, основывающийся на снятии апикального доминирования. Это может быть достигнуто двумя путями:

1. Удаление верхушечной меристемы стебля (снятие апикального доминирования) и последующее микрочеренкование побега in vitro на безгормональной среде. Апикальное доминирование — подавление роста боковых почек растительного побега или наличие терминальной почки.

2. Добавление в питательную среду веществ цитокининового типа действия, индуцирующих развитие многочисленных пазушных побегов. Как правило, в качестве цитокининов используют 6-бензиламинопурин (БАП) или 6-фурфуриламинопурин (кинетин), а также 2-изопентениладенин (2-iр) и зеатин. Полученные таким образом побеги отделяют от первичного материнского экспланта (инокулюм (трансплант) — часть суспензионной или каллусной культуры, переносимой в свежую питательную среду) и вновь самостоятельно культивируют на свежеприготовленной питательной среде, стимулирующей пролиферацию пазушных меристем и возникновение побегов более высоких порядков (рис. 4.2).


Рис. 4.2. Активация развития уже существующих в растении меристем, основывающаяся на снятии апикального доминирования: 1 -снятие апикального доминирования и последующее микрочеренкование побега in vitro на безгормоналыюй среде; 2 — индуцированное развитие многочисленных пазушных побегов под действием веществ цитокининового типа действия

В настоящее время этот метод широко используется в производстве безвирусного посадочного материала сельскохозяйственных культур, таких как технические (сахарная свекла, хмель, табак, топинамбур, стахис) и овощные (томаты, картофель, огурец, перец, тыква, спаржа и др.), а также для размножения культур промышленного цветоводства (гвоздика, хризантема, роза, гербера), тропических и субтропических растений (рододендрон, азалия, камелия, чай и др.), плодовых и ягодных культур (яблоня, слива, вишня, груша, виноград, малина, смородина, крыжовник и др.) и древесных растений (тополь, ива, ольха, береза, рябина, секвойя, туя, можжевельник и др.).

Для некоторых сельскохозяйственных культур, таких как картофель, технология клонального микроразмножения поставлена на промышленную основу (рис. 4.3). Применение метода активации развития существующих в растении меристем позволяет получать из одной меристемы картофеля более 105 растений в год, причем технология предусматривает получение в пробирках микроклубней — ценного безвирусного семенного материала.
Формирование растения капусты из пазушной почки показано на рис 4.4.

Источник

IX Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум — 2017

Пионером клонального микроразмножения считается французский ученый Жан Морель, который в 50-х годах двадцатого века получил первые растения — регенеранты орхидей. В это время техника культивирования апикальных меристем in vitro была уже хорошо разработана. Как правило, исследователи в качестве первичного экспланта использовали верхушечные меристемы травянистых растений: гвоздики, хризантемы, подсолнечника, гороха, кукурузы и т.д. В нашей стране работы по клональному микроразмножению были начаты в 30-х годах в лаборатории культуры тканей и морфогенеза ИФРа. Под руководством Р.Г.Бутенко были изучены условия микроразмножения картофеля, сахарной свеклы, гвоздики, герберы и др. растений и предложены промышленные технологии. В дальнейшем исследования по клональному микроразмножении охватили и древесные растения.

Читайте также:  Обратный осмос для полива растений

Первые работы по культуре тканей древесных растений были опубликованы в середине 20-х годов нашего столетия и связаны с именем Готре, который показал, что камбиальные ткани некоторых растений способны к каллусогенезу in vitro. Но первые растения — регенеранты осины, доведенные до почвенной культуры, были получены лишь в середине 60-х годов Матесом.

Культивирование тканей хвойных пород in vitro долгое время редко использовалось как объект исследования. Это было связано со специфическими трудностями культивирования тканей, изолированных из растения. Известно, что древесные, и особенно хвойные растения характеризуются медленным ростом, трудно укореняются, содержат большое количество вторичных соединений (фенолы, терпены и т.д.), которые в изолированных тканях активируются. Окисленные фенолы обычно ингибируют деление и рост клеток, что ведет к гибели первичного экспланта или уменьшению способности тканей древесных растений к регенерации адвентивных почек, которая с возрастом растения-донора исчезает практически полностью. В настоящее время, несмотря на перечисленные трудности, насчитывается более 200 видов древесных растений из 40 семейств, которые были размножены in vitro (каштан, дуб, береза, клен, сосна, ель, секвойя и др.).

Этапы микроклонального размножения:

1. Выбор растения-донора, изолирование эксплантов и получение хорошо растущей стерильной культуры.

2. Собственно микроразмножение, когда достигается получение максимального количества меристематических клонов.

3. Укоренение размноженных побегов с последующей адаптацией их к почвенным условиям, а при необходимости депонирование растений-регенерантов при пониженной температуре (+2 о С, +10 о С).

4. Выращивание растений в условиях теплицы и подготовка их к реализации или посадке в поле.

Для культивирования тканей на каждом из четырех этапов требуется применение определенного состава питательной среды.

На первом этапе необходимо добиться получения хорошо растущей стерильной культуры. В тех случаях, когда трудно получить исходную стерильную культуру экспланта, рекомендуется вводить в состав питательной среды антибиотики (тетрациклин, бензилпенициллин и др.) в концентрации 100—200 мг/л. Это в первую очередь относится к древесным растениям, у которых наблюдается тенденция к накоплению внутренней инфекции.

На первом этапе, как правило, используют среду, содержащую минеральные соли по рецепту Мурасига и Скуга, а также различные биологически активные вещества и стимуляторы роста (ауксины, цитокинины) в различных сочетаниях в зависимости от объекта. В тех случаях, когда наблюдается ингибирование роста первичного экспланта, за счет выделения им в питательную среду токсичных веществ (фенолов, терпенов и других вторичных соединений), снять его можно, используя антиоксиданты. Это возможно двумя способами: либо омывкой экспланта слабым его раствором в течение 4—24 ч, либо непосредственным добавлением в питательную среду. В качестве антиоксидантов используют: аскорбиновую кислоту (1 мг/л), глютатион (4—5 мг/л), дитиотриэтол (1—3 мг/л), диэтилдитиокарбомат (2—5 мг/л), поливинилпирролидон (5000—10000 мг/л). В некоторых случаях целесообразно добавлять в питательную среду адсорбент — древесный активированный уголь в концентрации 0,5—1%. Продолжительность первого этапа может колебаться от 1 до 2 месяцев, в результате которого наблюдается рост меристематических тканей и формирование первичных побегов.

2 этап — собственно микроразмножение. На этом этапе необходимо добиться получения максимального количества мериклонов, учитывая при этом, что с увеличением субкультивирований увеличивается число растений-регенерантов с ненормальной морфологией и возможно наблюдать образование растений-мутантов.

Как и на первом этапе, используют питательную среду по рецепту Мурасига и Скуга, содержащую различные биологически активные вещества, а также регуляторы роста. Основную роль при подборе оптимальных условий культивирования эксплантов играют соотношение и концентрация внесенных в питательную среду цитокининов и ауксинов. Из цитокининов наиболее часто используют БАП в концентрациях от 1 до 10 мг/л, а из ауксинов—ИУК и НУК в концентрациях до 0,5 мг/л.

При долгом культивировании растительных тканей на питательных средах с повышенным содержанием цитокининов (5—10 мг/л) происходит постепенное накопление их в тканях выше необходимого физиологического уровня, что приводит к появлению токсического действия и формированию растений с измененной морфологией. Вместе с тем, возможно наблюдать такие нежелательные для клонального микроразмножения эффекты, как подавление пролиферации пазушных меристем, образование витрифицированных (оводненных) побегов и уменьшение способности растений к укоренению. Отрицательное действие цитокининов возможно преодолеть, по данным Н.В. Катаевой и Р.Г. Бутенко, путем использования питательных сред с минимальной концентрацией цитокининов, обеспечивающих стабильный коэффициент микроразмножения, или путем чередования циклов культивирования на средах с низким и высоким уровнем фитогормонов.

3 и 4 этапы — укоренение микропобегов, их последующая адаптация к почвенным условиям и высадка в поле являются наиболее трудоемкими этапами, от которых зависит успех клонального микроразмножения. На третьем этапе, как правило, меняют основной состав среды: уменьшают в два, а иногда и в четыре раза концентрацию минеральных солей по рецепту Мурасига и Скуга или заменяют ее средой Уайта, уменьшают количество сахара до 0,5—1% и полностью исключают цитокинины, оставляя один лишь ауксин. В качестве стимулятора корнеобразования используют β-индолил-3-масляную кислоту (ИМК), ИУК или НУК.

Список литературы: 1) Айала Ф., Кайгер Дж. Современная генетика 3 тома. М., "Мир",1988г.5 2) Алиханян С.И., А.П. Акифьев, Л.С. Чернин. Общая генетика: Учеб. для студ. биол. спец. ун-тов. М.: Высшая школа, 1985. 3) Бахтеев Ф. Х. Академик Николай Иванович Вавилов, «Бюллетень Московского общества испытателей природы. Отд. биологический», 1958, т. 63, в. 3; 4)Дубинин Н. П., Общая генетика, М., 1970. 5) Лобашев М. Е., Ватти К.В., Тихомирова М.М. Генетика с основами селекции, М. Просвещение, 1979.

Источник

КЛОНАЛЬНОЕ МИКРОРЛЗМНОЖЕНИЕ РАСТЕНИЙ

Клональное микроразмножение — получение в условиях in vitro (в пробирке), неполовым путем растений, генетически идентичных ис­ходному экземпляру — принципиально новый метод вегетативного размножения. В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки реализовывать присущую ей тотипотентность, т.е. под влиянием экзогенных воздействий давать начало целому растительному организму.

Преиму­щества над традиционными способами размноже­ния:

· получение генетически однородного посадочного материала;

· освобождение растений от вирусов;

· высокий коэффициент размножения. (Ю 5 .: Л0 б — для травяни­стых, цветочных растений, 10 4 . 10 5

для кустарниковых древесных, 10 4 — для хвойных);» ‘

· сокращение продолжительности селекционного процесса;

· ускорение перехода растений от ювекильной к репродуктив­ной фазе развития;

· размножение растений, трудно размножаемых традиционны­ми способами;

· возможность проведения работ в течение круглого года и экономия площадей, необходимых для выращивания посадочного материала:

· возможность автоматизации процесса выращивания.

Методы размножения растений

Процесс клонального микроразмножения разделяют на четыре этапа:

1. выбор растения — донора, изолирование зкеняантов и получе­ние хорошо растущий стерильной культуры;

2. собственно микроразмножение, когда достигается получение максимального количества микропобегов;

3. укоренение размноженных побегов и приспособление-их к поч­венным условиям;

4. выращивание растений в условиях теплицы и подготовка их к реализации или посадке в поле.

Исходя из предложенных в литературе методов микроразмножения растений этот процесс можно осуществлять следующими; метода­ми:

— активизацией развития уже существующих в растении мери­стем;

— индукцией соматическою эмбриогенеза;

— дифференциацией адвентивных ночек в первичной и пересадочной каллусной ткани.

Первый метод используемый при клональном микроразмножении растений — это активация развитии уже существующих в растении меристем, основывающийся на снятии апикального доминирования. Это может быть достигнуто двумя путями:

— удаление верхушечной меристемы стебля и последующее микрочеренкование побега in vitro на безгормональной среде;

— добавление в питательную среду веществ цитокининового типа действия, индуцирующих развитие многочисленных пазушных побегов.

Второй метод — это индукция возникновения адвентивных непосредственно тканями зкспланта. Он основан на способности изолированных частей растения при благоприятных условиях питательной среды восстанавливать недостающие органы и таким об­разом регенерировать целые растения. Образования адвентивных почек возможно добиться почти из любых органов и тканей растения (изолированного зародыша, листа, стебля, семядолей, чешуек и донца луковицы, сегментов корней и зачатков соцветий), если их удается получить свободными от инфекции.

Таким образом, от одного материнского растения можно полу­чать несколько миллионов раетений-регенерантов в год.

Третий метод, практикуемый ври клональном микроразмножении, основывается на дифференциациииз соматических клеток зародышеподобных структур, которые по своему внешнему виду напоминают зиготические зародыши. Этот метод получил назва­ние соматический эмбриогенез. Основное отличие образования зародышей in vitro от in vivo (в естественных условиях) заключается в том, что соматические зародыши развиваются асексуально вне зародышевого мешка и по своему внешнему виду напоминают биполярные структуры, у которых одновременно наблюдается развитие апикальных меристем стебля и корня.

Четвертый метод клонального микроразмножения — диффе­ренциация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллус­ной ткани. Практически он мало используется для получения по­садочного материала in vitro, т.к. при периодиче­ском пересаживании каллусной ткани часто наблюдаются нежелательные изменения плоидности культивируемых клеток, структурные пере­стройки хромосом и накопление генных мутаций. Наряду с генетиче­скими изменениями наблюдаются изменения и по морфоло­гии: низкорослость, неправильное жилкование листьев и их располо­жение по стеблю, образование укороченных, утолщенных междоуз­лий, уродливость, пониженная устойчивость к болезням и вредите­лям

Читайте также:  Лавровый лист растение как определить

Однако данный метод име­ет свои положительные стороны и преимущества. Во-первых, он эффективен и экономически выгодный, т.к. в процессе раз­множения из каждой индивидуальной каллусной клетки может сформиро­ваться адвентивная почка, дающая начало новому растению. Во-вторых, в ряде случаев он является единственно возможным способом й размножения растений в культуре тканей. В-третьих — представляет большой интерес для селекционеров, т.к. растения полученные данным методом, отличаются генетически и морфологически друг от друга.

Питательные среды. Любая питательная среда включает в себя: макро- и микроэлементы, углеводы, витамины, аминокислоты, регуляторы роста гормональной природы.

Обязательным условием является присутствие в среде кроме эле­ментов питания гормональных факторов или имитаторов их действия. Известно пять групп соединений, относящихся к категории фитогормонов. Это цитокинины, ауксины, гиббереллины, абсцизовая кислота и этилен. При in vitro было выявлено, что для пре­вращения специализированной клетки в меристематическую, способ­ную к делению, необходимо участие двух и более гормонов, относя­щихся к разным группам.

Условия культивирования. После тщательного перемешивания компонентов питательной среды регулируется рН всей смеси путем до­бавления 0,1 N NaOH и 0,1 N НС1.

Факторы окружающей среды, такие как свет, температура и со­став воздуха, влияют на рост и развитие клеток в культуре орга­нов и тканей. Действие этих факторов взаимосвязано.

Процесс микроразмножения растений состоит из трех этапов:

— эксплантирование исходного материала,

— укоренение размноженных побегов.

При получении посадочного материала дре­весных растений методом микроклонирования можно выделить и четвертый этап

— адаптации регенерантов к нестерильным условиям среды .

Отбор экстантов и введение их в культуру. Для микрораз­множения древесных растений используют два основных типа исход­ного материала:

— ювенильный (семена и их отдельные части, а также части про­ростков);

— молодые ткани взрослых растений (почки, хвоя, ткани листа, побеги).

Перед введением в культуру материал стерилизуют. Стерилизующие растворы могут быть разделены на несколько групп. Первая из них включает растворы, содержащие активный хлор: хлорамин, хлорная известь, гипохлорит кальция и гипохлорит натрия. Вторая группа включает ртутьсодержащие растворы, обладающие наибольшим дезинфицирующим эффектом: хлорид ртути и диацид. Растворы второй группы используют в тех случаях, когда препа­раты первой группы оказались неэффективными.

Перед высадкой на питательную среду материал ополаскивают в стерильной воде.

Мультипликация побегов. При правильно подобранной пита­тельной среде, надежной стерилизации и подходящих условиях культивирования в пробирке или колбе образуется несколько побегов. Часть из них пересаживают на новую среду для образования корней, а другую повторно культивируют для увеличения количества побегов. Этот процесс повторяют многократно до получения требуемого количества посадочного материала.

Ризогенез. Питательная среда для культивирования побегов с целью образования на них корней отличается от среды, которая использовалась на первом этапе. Для многих растений необходимо использовать среду с низким содержанием солей. Время, необходимое для формирование корней, варьирует от 10 до 15 дней. Растения из пробирки пересаживают, когда корни достигнут 5 мм длины. Более длинные корни могут при пересадке поломаться.

Адаптация к нестерильным условиям среды. Для переноса рас­тений из культуральных сосудов в почву требуется особая осторож­ность. Корни промываются для удаления налипшей на них питательной среды. Первые 10-15 дней в теплице поддерживается высокая влажность (90-100%).

Процесс адаптации пробирочных растений к почвенным усло­виям наиболее дорогостоящая и трудоемкая операция. Не­редко после пересадки растений в почву наблюдается остановка в рос­те, опадение листьев и гибель растений. Это связано во первых с тем, что у растений нарушается деятельность устьичного аппарата, вследствие чего происходит потеря большого количе­ства воды. Во-вторых, у некоторых растений в условиях in vitro не про­исходит образования корневых волосков, из-за этого, нарушается поглощение воды и минеральных солей из почвы. Поэтому на третьем или четвертом этапах клонального микроразмножения применяется искусственная микоризация растений (для микотрофных), учитывая положительную их роль в снабжении растений минеральными и органическими питательными веществами, водой, биологически активными веществами, а также в защите расте­ний от патогенов. Существует два способа заражения растений микоризообразующими грибами, in vitro (в стерильных условиях); in vivo (в естественных условиях). Первый способ более благоприятен, так как в этом случае исключается возможность загрязнений почвы, другими микроорганизмами.

Оздоровление посадочного материала

Преимущество клонального микроразмножения — это получение генетически однородного, безвирусного посадочного материала. Это возможно достичь, используя меристемные ткани апексов и пазушных почек органов стеблевого происхождения. Как правило, меристема состоит из конуса нарастания, а также одного или двух листовых зачатков (примордий) и является свободной от инфек­ции.

Строение точки роста растений имеет свою специфику: дистальная её часть, представленная апикальной меристемой, у разных рас­тений имеет средний диаметр до 200 мкм, высота от 20 до 150 мкм. В более нижних слоях дифференцирующиеся клетки меристемы об­разуют прокамбий, дающий начало пучкам проводящей системы. Известно, что успех клонального микроразмножения зависит от размера меристематического экспланта: чем больше листовых зачатков и тканей стебля, тем легче идет процесс морфогенеза, заканчиваю­щийся получением целого нормального пробирочного растения.

Применение электронной микроскопии часто обнаруживает наличие вирусов в меристеме пораженных ими растений что, подтверждает что количество лишенных вируса растений после подобной операции чрезвычайно мало и многие меристемы пораженных растений инфекционны.

Таким образом, эффективность применения апикальной меристемы в качестве метода оздоровления зараженных вирусами расте­ний оказывается низкой.

В принципе возможно получение безвирусной апикальной ме­ристемы от больного растения, но при этом риск попадания вирусов в здоровые ткани должен быть снижен до нуля. Это может быть дос­тигнуто путем применения предварительной термотерапии исходных растений или хемотерапии.

Метод термотерапии применяется как в условиях in vitvo, так in vitro и предусматривает использование сухого горячего воздуха.

Растения, подвергающиеся термотерапии, помещают в специ­альные термокамеры, где в течение первой недели повышают темпе­ратуру от 25 до 37°С путем ежедневного увеличения параметров тем­ператур на 2°С. Важно при термотерапии создавать и под­держивать оптимальные режимы: тем­пературу 37°С, освещенность лампами дневного света 5 тыс. лк, фото­период 14. 16 ч в сутки при относительной влажности воздуха в термокамере 90%. Продолжительность термотерапии всецело зависит от состава вирусов и их термостойкости.

Другой способ, применяемый для освобождения растений от вирусов, — хемотерапия. Он заключается в добавлении в питательную среду, на которой культивируют апикальные меристемы, аналога гуанозина — 1в . -Д-рибофуранозил — 1, 2, 4 — триазол-З-карбоксимид (коммер­ческое название вирозол) концентрацией 20. 50 мг/л. Это противовирусный препарат широкого спектра действия. При его использовании в культуральной среде процент безвирусных меристемных расте­ний для ряда обычных для этих растений вирусов увеличивался до 80. 100% при 0. 41% в контроле.

Возраст исследуемого материала.Возраст первичного экспланта существенно влияет и на укоренение микропобегов, размноженных in vitro. С увеличением возраста исходного материала, как правило, сни­жается способность побегов к укоренению.

Несомненно, с практической точки зрения целесообразно раз­множать растения, и в частности древесные, в возрасте старше 20 лет. Однако размножение их in vitro в таком возрасте представляет большие трудности. Во-первых, все типы тканей и органов у взрослых растений эндогенно заражены грибами и бактериями, что значительно затрудняет получение асептической культуры. Во-вторых, почки или другие органы одного и того же взрослого дерева различаются между собой по поведению в условиях in vitro гораздо больше, чем это имеет место у травянистых растений, что приводит к проведению специальных экспериментов по подбору оптимальных условий куль­тивирования, обеспечивающих нормальный рост и развитие вновь введенных эксплантов в культуру.

В настоящее время преодоление возрастного барьера осуществ­ляется путем реювенилизации — сочетание работ in vivo и in vitro. Реювенилизацию (омоложение) можно проводить несколькими путя­ми:

— многократной обработкой растущего дерева или отдельных ветвей раствором цитокинина перед эксплантированием;

— частой подрезкой деревьев для индукции роста побегов непо­средственно из ствола дерева или для стимуляции корневых отпры­сков;

— проведением повторных прививок;

— путем серии субкультивирований (in vitro);

— созданием густых насаждений, обеспечивающих боковое зате­нение, которое будет стимулировать развитие спящих почек.

Клональное микроразмножение растений является новым перспективным спосо­бом вегетативного размножения, позволяющим получать генетиче­ски однородный, оздоровленный посадочный материал, иметь вы­сокий кооффициент размножения, сокращать селекционный процесс, проводить работы в течение года, экономя при этом площади, не­обходимые для выращивания растений. Во многих странах мира биоиндустрия микроклонального размножения поставлена на поточ­ную промышленную основу и представлена десятками активно функ­ционирующих предприятий. В настоящее время многие научно-следовательские институты и про­мышленные лаборатории разрабатывают и усовершенствуют методы микроразмножения и оздоровления различных декоративных, плодо­вых, ягодных, овощных, кормовых и древесных культур.

Источник